之前我們曾探討過亮藍(lán)分析有雜峰干擾的原因和靛藍(lán)分析回收率不穩(wěn)定的原因，亮藍(lán)分析有雜峰干擾是因?yàn)榱了{(lán)存在3個同分異構(gòu)體，靛藍(lán)回收率不穩(wěn)定是因?yàn)闇囟取⒐庹?、時間等因素會影響靛藍(lán)溶液的穩(wěn)定性。

關(guān)于合成著色劑的分析我們有一系列的小知識想和大家分享，今天為大家?guī)淼氖顷P(guān)于赤蘚紅分析時回收率不穩(wěn)定的原因。

本文所指的赤蘚紅，CAS是16423-68-0，我們稱之為赤蘚紅是參考《GB 5009.35-2016 食品安全guo家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測定》，在某些文獻(xiàn)資料中大家可能會看到將CAS是16423-68-0的物質(zhì)稱之為赤蘚紅B，主要由于俗稱的問題。網(wǎng)上搜索赤蘚紅，你一定會搜索到兩個不同CAS的化合物，還有一個CAS號是568-63-8，通過比較化學(xué)式，可以看出這兩個化合物互為同分異構(gòu)體。CAS號是化合物的身fen證，是化合物的唯yi標(biāo)示，在合成著色劑分析時受俗稱的影響，很容易選錯分析對象，建議大家在選購合成著色劑的時候，一定要將CAS號作為唯yi標(biāo)識。

CAS：16423-68-0 

CAS：568-63-8

在GB 5009.35中有一種合成著色劑的提取方法：聚酰胺吸附法。在操作的時候很不方便，目前已經(jīng)有商品化的聚酰胺固相萃取小柱代替，比如安譜實(shí)驗(yàn)的CNW Poly-sery PA 聚酰胺小柱，因其操作方便、節(jié)省時間、節(jié)省試劑、對多種合成著色劑處理后結(jié)果準(zhǔn)確且回收率高，因而備受廣大消費(fèi)者的青睞，將其用于8種合成著色劑的前處理實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果如下文所示。

SPE

小柱：CNW Poly-sery PA 聚酰胺小柱  （500mg/6mL）

活化：5mL甲醇

平衡：5mL 水

上樣：5mL 1ppm 8種合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)品，溶劑檸檬酸溶液（pH 3.0~4.0）

淋洗：5mL 甲醇：甲酸：去離子水（4：2：4）（V/V/V），淋洗后抽干小柱中的溶液

洗脫：3mL*2 10%氨水甲醇

收集洗脫液，并于50℃氮吹至干，用甲醇：0.02M乙酸銨溶液（1:1）定容至1mL，充分溶解后，上機(jī)分析。

儀器條件

色譜柱： C18-Wp（4.6mm*250mm，5um）

流動相：A:甲醇B：0.02M乙酸銨

梯度洗脫：0min 15%A，5min 35% A，12~22min 95%A，22.5~30min 15 %A

流速：1.0mL/min

柱溫：25℃

波長：254nm

進(jìn)樣量：10ul

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 8種合成著色劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，除赤蘚紅之外，其他7種合成著色劑的回收率均大于90%，RSD小于5%，赤蘚紅回收率較低，且多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其回收率在70%~90%之間，回收率不穩(wěn)定。

原因分析

那么到底是什么原因?qū)е鲁嗵\紅回收率不穩(wěn)定呢。仔細(xì)閱讀國標(biāo)，可以發(fā)現(xiàn)對于含赤蘚紅的樣品，其提取方法采用的是液液——分配法，而非聚酰胺吸附法，但是國標(biāo)并沒有對赤蘚紅為何不能采用聚酰胺吸附法做解釋說明。結(jié)合赤蘚紅的化學(xué)結(jié)構(gòu)和GB 5009.35我們來分析一下原因。

液-液分配法原理，加鹽酸使赤蘚紅結(jié)構(gòu)上的Na反應(yīng)后變?yōu)镠，赤蘚紅分子上的酚羥基與三正辛胺分子中的氮原子形成氫鍵，生成不溶于水的化合物，被萃取到正丁醇中，加飽和硫酸鈉去除有機(jī)相中殘留的水分，正己烷去除油脂類雜質(zhì)，用氨水做反萃溶劑，加入氨水，使化合物的氫鍵斷裂，赤蘚紅進(jìn)入水相，乙酸調(diào)pH至中性，濃縮后待測。

聚酰胺吸附法的原理，聚酰胺是由酰胺鍵聚合形成的高分子化合物，其酰胺基可與羥基酚類、酸類、醌類、硝基等化合物以氫鍵形式結(jié)合而被吸附。其他7種合成著色劑均含有較多的磺酸鈉基團(tuán)，在酸性條件下轉(zhuǎn)變成磺酸根，與聚酰胺的結(jié)合很緊密，甲醇-甲酸溶液并不能使其分離，可以作為淋洗溶劑，淋洗掉一些雜質(zhì)，加水也不能將其分離，同時可以洗去一些水溶性雜質(zhì)，加入乙醇-氨水-水，將合成著色劑解析出來，乙酸調(diào)pH至中性，濃縮后待測。SPE的方法也是利用了此原理，酸性條件上樣，使目標(biāo)物與聚酰胺結(jié)合，再用一定比例的甲醇：甲酸：去離子水淋洗去除雜質(zhì)，然后用氨水甲醇洗脫掉目標(biāo)物，濃縮復(fù)溶待測。所以這7種合成著色劑用聚酰胺粉和聚酰胺小柱均能得到較好的結(jié)果。而赤蘚紅在酸性條件下Na反應(yīng)后變?yōu)镠，酚羥基也能與聚酰胺結(jié)合而被吸附，但是在甲醇有機(jī)相存在的條件下，和聚酰胺的結(jié)合并不緊密，容易溶解在甲醇中隨著淋洗液流出，導(dǎo)致洗脫回收率低且不穩(wěn)定。通過設(shè)計(jì)淋洗和不淋洗步驟進(jìn)行結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)不淋洗時赤蘚紅的回收率大約93%，明顯高于淋洗時赤蘚紅的回收率80%左右。因聚酰胺在用于合成著色劑測定時淋洗可以除掉一些干擾分析的雜質(zhì)成分，故淋洗步驟很有必要，如果赤蘚紅和其它合成著色劑同時用聚酰胺小柱分析時，需要關(guān)注淋洗溶液和基質(zhì)的復(fù)雜程度，決定是否需要在淋洗液中加入甲醇有機(jī)試劑。

除了用聚酰胺小柱測定赤蘚紅時淋洗溶液不能用甲酸-甲醇溶液外，要使赤蘚紅的實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、回收率高還需要注意另外兩個方面的問題：

（1）上機(jī)之前過濾所用的濾膜不得使用尼龍濾膜，因?yàn)槟猃埖幕瘜W(xué)成分就是聚酰胺，會吸附合成著色劑；

（2）建議赤蘚紅上機(jī)溶液的溶劑中加入一定比例的甲醇，如甲醇：水（1：1）或甲醇：0.02M乙酸銨（1：1），而非用純水做溶劑。因?yàn)槲覀兌啻螌?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氮吹濃縮后，純水復(fù)溶，管壁上會殘留很多肉眼可見的赤蘚紅（紅色），經(jīng)過長時間的超聲、渦旋都很難溶解掉，上機(jī)分析回收率大約才20%左右，但加入一定比例的甲醇后很容易將赤蘚紅溶解下來，且甲醇本來也是流動相的一部分，用流動相做溶劑合情合理。